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dPCR概念及操作步驟詳解

更新時間:2023-07-28  |  點擊率:702

數(shù)字聚合酶鏈反應(Digital PCR,dPCR)是一種高度靈敏和準確的核酸檢測技術(shù),它通過將目標分子在大量微小反應單元中進行數(shù)字化擴增和檢測,實現(xiàn)對稀有或低拷貝數(shù)目標的可靠定量。本文將詳細介紹dPCR技術(shù)的原理,包括樣本分割、擴增、測定和數(shù)據(jù)分析的步驟,以幫助讀者深入理解這一先進的生物分析技術(shù)。

 

引言

聚合酶鏈反應(PCR)作為一種常用的核酸擴增技術(shù),已在分子生物學、醫(yī)學診斷和生物工程等領域發(fā)揮著重要作用。然而,傳統(tǒng)PCR技術(shù)在檢測低拷貝數(shù)目標時存在靈敏度不足、精確度有限等局限性。為了克服這些限制,dPCR技術(shù)應運而生。

 

dPCR的基本原理

dPCR的基本原理是將樣本中的目標分子均勻地分割成許多微小反應單元,并在每個反應單元中進行PCR擴增。通過對反應單元的陽性和陰性結(jié)果進行數(shù)字計數(shù),可以確定目標分子的存在與否,從而實現(xiàn)精確定量。

 

dPCR的步驟

a. 樣本準備:首先,從樣本中提取目標DNARNA,并根據(jù)需要進行適當?shù)念A處理,例如逆轉(zhuǎn)錄反應或DNA純化等。

 

b. 樣本分割:將樣本分割成大量微小反應單元,可以使用微滴數(shù)字PCR芯片、微流控芯片或數(shù)字PCR芯片等分割技術(shù)。每個反應單元包含零個或一個目標分子。

 

c. PCR擴增:在每個微小反應單元中進行PCR擴增。由于每個反應單元中僅包含少量目標分子,使得擴增達到飽和狀態(tài)的概率較小,從而減少了PCR擴增效率對結(jié)果的影響。

 

d. 結(jié)果測定:通常使用熒光探針、探針水解或熒光染料等方法對PCR產(chǎn)物進行檢測。根據(jù)產(chǎn)物是否達到熒光檢測閾值,可以判定每個反應單元是陽性還是陰性。

 

e. 數(shù)據(jù)分析:將陽性和陰性結(jié)果的數(shù)字計數(shù)與總反應單元數(shù)量相比較,即可得到目標分子的絕對拷貝數(shù),實現(xiàn)對目標分子的精確定量。

 

dPCR技術(shù)的優(yōu)勢

a. 高靈敏度:dPCR可以檢測稀有或低拷貝數(shù)目標,比傳統(tǒng)PCR技術(shù)更加敏感。

 

b. 高準確性:由于數(shù)字化的特性,dPCR消除了PCR擴增效率的影響,提供更加準確和可靠的定量結(jié)果。

 

c. 抗抑制性強:dPCR在復雜樣本中的表現(xiàn)優(yōu)秀,對樣本中存在的抑制物質(zhì)較為抗拒。

 

d. 可重復性好:數(shù)字化的dPCR技術(shù)具有出色的可重復性,可以在不同實驗室和不同時間重現(xiàn)相同的結(jié)果。

 

結(jié)論

數(shù)字聚合酶鏈反應(dPCR)作為一種高度精確的核酸定量技術(shù),已經(jīng)在許多領域展現(xiàn)出巨大的潛力和廣泛的應用前景。通過樣本分割、PCR擴增、結(jié)果測定和數(shù)據(jù)分析等步驟,dPCR能夠?qū)崿F(xiàn)對稀有或低拷貝數(shù)目標的可靠定量,為基礎研究、臨床診斷和生物工程等領域的科學研究和技術(shù)應用提供了強有力的支持。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,相信dPCR將在未來發(fā)揮越來越重要的作用,推動生物科學領域的進步和創(chuàng)新。


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